使用凯氏定氮法测定蛋白质含量

使用凯氏定氮法测定蛋白质含量

凯氏定氮法是一种非常常用的测量蛋白质含氮量的方法，因其原理简单，可操作性强，准确率高。

消化前样品处理

*固体样品: 某一固体样品中的含氮量是用100g该物质(干重)中所含氮的g数来表示(％)。

*固体样品105℃烘干至恒重。

用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样 品。每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。

*若样品为液体(如血清等)，可取一定体积样品直接消化测定。

消化

*取凯氏烧瓶 标号。各加几颗玻璃珠;

*1及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂200 mg，消化液5 mL。3及4号瓶中各加相同量的催化剂和消化液-----对照，以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。

消化开始时应控制火力，不使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力消化，直至消化液呈透明淡绿色。

*定容：冷却后，加蒸馏水(慢加，随加随摇)。将瓶中液体倾入50 mL或100 mL容量瓶，并以蒸馏水洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶，定容。

蒸馏吸收：改进型凯氏定氮仪

*特点：将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，操 作简便。

1)水蒸汽发生器和反应室

2)冷凝器和通气室

3)排水柱

*关键：搞清水管系统

【*蒸馏器的洗涤：

１.接通冷凝水，向蒸汽发生器中加入一定量的水(以排水口高度为宜)，酒精灯 加热烧开。

２.水的自动喷出：

将蒸馏水从加样室加入反应室

将酒精灯移开片刻，反应室内水自动喷出到蒸汽发生器

打开蒸汽发生器出水口，放水。

如此反复清洗3-5次。

３.清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有5 mL，2％硼酸溶液和1～2滴指示剂的 混合液。如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。】

蒸馏吸收

准备:

取50 mL锥形瓶3个，各加入5 mL 硼酸溶液和1滴指示剂，溶液呈淡紫色，表面皿覆盖备用。

关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。将锥形瓶放在冷凝器下，冷凝器下端浸没在液体内。

加样:

移液管取3 mL消化液（空白液和样品消化液分别做），加入反应室，用小量筒加NaOH溶液5mL，关闭自由夹，少量水封口。

蒸馏:

关闭自由夹，打开冷凝水。

点燃酒精灯，蒸馏开始，锥形瓶中溶液由淡紫色变绿时(约2-3分钟)开始计时，蒸馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，继续蒸馏1分钟，取下锥形瓶，表面皿覆盖。

蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。 重复3次。最后将自由夹同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏。

滴定

全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。

注意：使用前检查酸式滴定管漏不漏？漏的话，涂凡士林

滴定时一边滴一边摇，防止滴定过头！

及时记录读数

要求：空白液1次，样品消化液2次

计算（公式在图片中）

c为标准盐酸溶液摩尔浓度(0.0098M)；

V1为滴定样品消化液用去的盐酸溶液平均mL数；

V2为滴定空白液用去的盐酸溶液mL数；

w为样品重量(1g)。

14为氮的相对量子质量。

消化液总量500ml, 蒸馏时消化液用量3ml

样品蛋白质含量(％)=总氮量×6.25